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Utilisation d’huiles végétales ou minérales : un outil potentiel dans la lutte contre Varroa jacobsoni (1999)
Yves Le Conte, Marc Édouard Colin, Michaël Treilles, Didier Crauser et Alain Paris
INRA, Unité de Zoologie et Apidologie, Domaine Saint-Paul, Site Agroparc, 84149 Avignon Cedex 9

Dans un contexte de lutte intégrée contre Varroa jacobsoni, la mise au point d’outils complémentaires, chimiques, biotechniques et biologiques, est devenue nécessaire compte tenu de l’évolution de la parasitose face aux moyens classiques de lutte. Parmi ces outils, les huiles pulvérisées sur les abeilles représentent une piste que nous avons développée depuis plusieurs années sur la base d’observations faites en testant l’effet de kairomones ou d’huiles essentielles émulsifiées dans l’eau sur des abeilles parasitées, et sur la base de données bibliographiques existantes.

Il est en effet souvent rapporté l’intérêt des substances huileuses dans la répulsion ou la perturbation du comportement des insectes parasites des récoltes. Ainsi, Su et al (1972) citent l’huile essentielle de citron pour inhiber l’éclosion de la bruche Callobruchus maculatus F., Singh et al (1978) citent l’huile d’arachide et Messina et Renwick (1983) les huiles minérales pour combattre ce même ravageur. Chez les abeilles, les huiles végétales ont été testées avec succès pour le contrôle d’Acarapis woodi, acarien parasite du système respiratoire de l’abeille, soit seules (Sammatoro et al, 1994), soit associées à du menthol (Delaplane, 1992). Varroa jacobsoni était ensuite une cible de choix du fait de son aplatissement dorso-ventral, et donc du fait de son fort ratio surface-volume, caractéristique le rendant plus vulnérable aux huiles utilisées en dépôt. Il utilise également les pores de sa cuticule afin de contrôler ses échanges gazeux (Pugh et al, 1992), donc toute perturbation de ceux-ci par les huiles pouvait l’affecter. Sur Varroa jacobsoni, des huiles végétales ont été testées en conditions de laboratoire, en dépôt sur du papier absorbant au sein de la ruche (Kraus et Page, 1995), mais ces auteurs n’ont pas vu d’effet significatif en conditions naturelles.

Une étude préliminaire au développement nous semblait donc intéressante à effectuer ; la pulvérisation d’huile ayant des avantages majeurs décrits par Chapman (1967) :

• la pulvérisation est de meilleure qualité et plus dense qu’avec un produit aqueux, la déperdition étant moindre (Bode et al, 1985 et Luttrell, 1985),
• les huiles posent très peu de problèmes au niveau de la santé humaine,
• les insectes sont apparemment moins enclins à développer des résistances à leur encontre,
• les huiles minérales sont en général beaucoup moins chères que les produits chimiques les plus compétitifs, ce qui n’est pas le moindre des avantages pour un apiculteur.

Nous avons pulvérisé trois formulations différentes sur des colonies infestées maintenues sur dix cadres dans des ruches de type Dadant. L’huile a été appliquée à l’aide d’un pulvérisateur à pression d’air générant des gouttelettes de 0,5 à 1,5 mm, à une température extérieure supérieure à 12 °C et directement sur les abeilles de chacun des deux côtés des cadres. Cette opération nécessite donc de sortir tous les cadres pourvus d’abeilles de la ruche. Six à dix ml d’huile ont été pulvérisés en fonction de la force de la colonie. Le traitement a été répété trois fois à une semaine d’intervalle. Les varroas détachés des abeilles sont recueillis, puis comptés, au moyen de plateaux grillagés et de langes graissés. Après les trois traitements, les varroas restants sur les abeilles ont été évalués en plaçant des lanières d’Apistan ou d’Apivar dans les colonies pendant six à huit semaines.

Une première expérimentation réalisée en novembre sur 6 colonies sans couvain, traitées avec de l’huile de colza, a montré une efficacité de 94,5 ± 7,4 %.

Une deuxième expérimentation a été réalisée en octobre de l’année suivante sur des colonies renfermant de petites quantités de couvain (la moitié d’un cadre en moyenne) pour tester comparativement l’effet de l’huile de colza, de l’huile de paraffine et d’un mélange d’huile de paraffine et d’un tensioactif, le Tween 20. Après trois traitements, l’huile de colza a montré une moins bonne efficacité (57,1 %) sur des colonies avec couvain. Le mélange d’huile de paraffine plus tensioactif a donné le meilleur résultat (97 %) par rapport à la paraffine seule (80,6 %) (Le Conte et al, 1999).

Nous n’avons pas observé de mortalité suspecte d’abeilles à l’issue de ces traitements, et les colonies ont montré un développement normal. Un petit rucher expérimental de l’INRA, constitué de 9 colonies est traité exclusivement de cette façon depuis trois ans.

Un des inconvénients de cette méthode est le temps passé pour réaliser les trois traitements. De plus, le choix d’un pulvérisateur adéquat est très important car le mélange paraffine-tensio-actif qui semble être le plus efficace est très visqueux et donc difficile à pulvériser. C’est pourquoi ces résultats doivent être considérés comme préliminaires et peut-être comme la base d’une méthode plus simple et efficace contre le varroa.

En 1998, nous avons pu continuer nos recherches dans ce domaine pour optimiser cette méthode, grâce au soutien des apiculteurs (fonds FEOGA-INRA et DGAL-production Biologique).

Nous voulions évaluer l’efficacité d’huiles minérales sur Varroa jacobsoni, seules ou en association avec d’éventuels adjuvants (tensioactif ou diluant), puis définir des caractéristiques précises concernant leurs conditions d’application, afin de pouvoir proposer aux apiculteurs un traitement bien codifié, avec des caractéristiques définies et constantes.

Sur la base des résultats obtenus, nous nous étions donc fixés (i) de choisir l’huile ou un mélange avec le pulvérisateur, les plus adéquates pour développer ce moyen de lutte, et (ii) de les tester sur le terrain.

Pour le choix d’une huile, nous avons développé des expérimentations de laboratoire, qui consistaient à pulvériser différentes huiles sur des varroas et d’en observer la survie.

Les tests de terrain ont eu pour but de vérifier l’efficacité de l’huile sélectionnée sur des colonies infestées.

Les expérimentations de laboratoire : efficacité directe des substances huileuses sur la survie de varroa. Pour chaque manipulation, des femelles varroas ont été prélevées dans du couvain et déposées dans le fond d’une boîte de Pétri. La boîte ouverte est ensuite soumise à la pulvérisation dans une tour de Potter-Bugerjon (1956, 1964), permettant d’obtenir le dépôt homogène d’un liquide sur une surface. Par similarité avec les expérimentations menées sur l’action des produits phytosanitaires sur les organismes utiles (Hassan et al, 1985 ; Blaisinger, 1987), nous avons choisi de définir des conditions de pulvérisation permettant d’obtenir un dépôt de liquide de 1 à 2 mg/cm2.

Les acariens ont été ensuite délicatement prélevés à l’aide d’un pinceau et déposés cinq par cinq dans une petite boîte de Pétri (35 mm de diamètre) contenant une nymphe d’abeille sur laquelle ils peuvent se nourrir. L’ensemble des boîtes a été alors porté en chambre climatisée à température et humidité relative constantes, en rapport avec le thermopréférendum de Varroa jacobsoni, évalué à 32,6°C (+/-2,9°C) (Le Conte et Arnold, 1988). L’atmosphère est donc à 34°C (+/-1°C) et 50 % HR (+/-10 %). Ces conditions sont également favorables à la survie des nymphes d’abeille.

Aux temps To, To +2h et To +17h, les varroas ont été observés sous loupe binoculaire grossissante (12X) afin d’en noter la mortalité. To correspond à la fin du transfert des parasites sur les petites boîtes de Pétri, environ 10 minutes après la fin de la pulvérisation, et To +17h ayant été choisi car donnant le plus d’information après une nuit à l’étuve.

Les parasites sont considérés comme morts si l’on n’observe aucun mouvement de leur part après stimulation physique (French-Constant et Roush, 1992).

La manipulation a été effectuée quatre fois, à raison de 15 varroas par huile plus 15 varroas témoin eau distillée, ce qui porte à 60 le nombre de parasites testés pour chaque huile.

Les huiles minérales sont des sous-produits de distillation et de raffinage des huiles de pétrole. Nous avons essayé uniquement des huiles dites de paraffine, les quatre huiles sélectionnées dans notre expérimentation étant dénuées de toxicité pour l’environnement, utilisées en pharmacie ou cosmétique et agréées par la pharmacopée européenne. Leur différence tient essentiellement en leurs qualités physiques et leur degré de raffinage. Ces huiles sont toutes peu onéreuses.

La première phase de cette expérimentation a consisté à tester quatre huiles pures, différentes du fait de leurs caractéristiques opposées en matière de viscosité et de raffinage, afin de déceler une éventuelle différence d’efficacité entre elles.

La seconde phase consistait à tester l’influence d’additifs (tensioactif et fluidifiant) sur l’efficacité des huiles. L’efficacité comparée des tensioactifs avec les huiles pures était intéressante à analyser car ceux-ci auraient un effet complémentaire de dissociation des éléments de l’épicuticule et de la procuticule de l’acarien (Richards, 1953). Les acariens portant en majorité une charge négative leur rôle était aussi de permettre un meilleur étalement de l’huile à la surface de ceux-ci. L’intérêt réside dans le fait de savoir si le tensioactif joue un rôle important dans la toxicité de l’huile en permettant une meilleure pénétration à travers la cuticule ou un meilleur étalement à la surface de celle-ci, et si le fluidifiant modifie l’effet acaricide de l’huile sachant de la fluidification permet une pulvérisation plus intéressante en pratique car moins longue. Deux huiles ont été testées avec un diluant et un tensioactif, tout deux sont également dénués de toxicité et utilisés en pharmacie ou cosmétique.

À To, environ 10 minutes après la fin de la pulvérisation, la mortalité des parasites était relativement importante, comprise entre 56 % et 72 %. Les varroas étaient très peu mobiles, même s’ils étaient encore vivants, sans pour autant être englués dans l’huile car ils pouvaient se mouvoir lorsque stimulés à l’aide d’une petite tige de métal. Après deux heures en chambre climatisée, la mortalité s’accentuait et on ne trouvait aucun varroa en mouvement, alors qu’aucun parasite soumis à la pulvérisation d’huile ne s’était positionné sur une nymphe. Sur les disques témoins, en revanche, les cinq parasites avaient presque toujours trouvé la nymphe sur laquelle ils restaient pour se nourrir. On n’a pas pu dégager de différence au niveau de l’efficacité entre les quatre huiles, il faudra donc se reporter sur des critères plus pratiques de conditions d’utilisation ou de prix. Lors de chaque observation, il est important de remarquer qu’aucun des varroas soumis à la pulvérisation d’huile n’a un comportement normal vis-à-vis de la source de nourriture qu’est la nymphe. Même toujours vivants, les parasites intoxiqués ne se dirigent pas vers celle-ci, qu’ils en soient proches ou non.

Le nombre de parasites nécessaires au test de chaque huile additionné de tensioactif étant trop grand, nous avons décidé de tester deux d’entre elles ayant des caractéristiques physiques et chimiques opposées afin de mesurer leur action. Au vu des résultats obtenus et de l’efficacité déjà importante des huiles seules, l’adjonction detensioactif n’apporte aucun élément complémentaire, tant au niveau de l’efficacité qu’au niveau du comportement de l’acarien vis-à-vis de la nymphe.

Les tests mis en œuvre au cours de cette étude ont permis de caractériser l’effet acaricide sur varroa de certaines huiles minérales qui, toutes, ont une activité acaricide importante et rapide dans les conditions de laboratoire. Cette mortalité est de type aiguë, survenant dans les heures qui suivent la pulvérisation. Le principe même de la toxicité de ces huiles est encore flou.

En dehors de l’activité acaricide, il conviendra aussi de s’intéresser aux aspects pratiques de la pulvérisation de ruches et, pour cela, les huiles très fluides (plus raffinées) semblent mieux indiquées, le temps de pulvérisation court étant moins traumatisant pour la colonie et l’apiculteur. On retiendra donc l’utilisation d’huiles minérales pures fluides comme meilleur compromis entre efficacité et facilité d’utilisation qui nous semble liée à la fluidité.

Après cette étude in vitro, l’étape suivante était l’essai de ces huiles sur des colonies infestées afin de connaître leur incidence in vivo sur des populations d’acariens. D’après les travaux effectués précédemment aux États-Unis (Rodriguez, communication personnelle), la fécondité de la reine, la croissance des larves et l’activité des ouvrières n’en seraient pas affectées. De même que le miel ne garderait pas trace du traitement après la rapide ventilation de la ruche par les abeilles. Mais tout ceci reste encore à vérifier.

Le choix d'un pulvérisateur
Pour pouvoir sélectionner un pulvérisateur adéquat, nous avons fait appel à plusieurs sociétés. Ayant déjà expérimenté des pulvérisateurs manuels, nous nous sommes orientés vers cette solution qui peut, évidemment, être améliorée par le futur.

La difficulté réside dans le fait que les corps gras sont beaucoup plus lourds que les substances aqueuses et ont de la difficulté à se pulvériser. Nous avons testé une trentaine de pulvérisateurs de marques différentes et seuls deux d’entre eux généraient des gouttelettes d’un diamètre de 0,5 à 2 millimètres.

Test de terrain
Sur la base des résultats des travaux en laboratoire, nous avons donc retenu l’huile la plus fluide pour notre étude de terrain, pour plusieurs raisons :

• elle a montré l’efficacité acaricide la plus grande,
• elle est utilisée dans l’alimentation humaine,
• elle est beaucoup plus fluide que les autres, ce qui rend sa pulvérisation beaucoup plus pratique.

Efficacité thérapeutique de l’huile sélectionnée

20 colonies parasitées de varroas ont été traitées trois fois, à raison de 20 ml d’huile en moyenne par traitement et par colonie, à J0, J12 et J26. Les traitements ont débuté le 22 octobre 1999.

À cette date, les colonies comportaient deux cadres de couvain en moyenne.

Les chutes de varroas ont été dénombrées grâce à des plateaux spécialement fabriqués et permettant de prélever les varroas sans perturber les colonies.

À J57, un traitement avec Apivar a été réalisé pour estimer les varroas restants non traités par les huiles.

Les résultats montrent une efficacité de 91 % après trois traitements.

Comparaison de l’efficacité d’huile avec ou sans tensioactif.

Pour confirmer les résultats obtenus en laboratoire, nous avons également testé l’huile avec et sans ajout de Tween 20.

10 colonies parasitées ont été traitées de la même façon que précédemment avec l’huile la plus fluide, et 10 autres colonies ont été traitées avec un mélange de cette même huile plus 5 % de tensioactif Tween 20.

Les résultats n’ont pas montré une meilleure efficacité du mélange avec le tensioactif.

Suivi des colonies
Les colonies traitées avec cette huile fluide ont malheureusement eu un taux de survie problématique puisque la moitié d’entre elles sont mortes pendant l’hiver. Bien que nous ne pouvions pas impliquer directement le traitement avec cette huile, car un témoin non traité n’a pas pu être réalisé, ces résultats montrent bien le caractère encore expérimental des résultats que nous publions dans cet article. Donc, nous déconseillons aux apiculteurs d’utiliser ces méthodes avant qu’elles aient été testées complètement  et que l’on ait toute garantie sur la tolérance de l’abeille au traitement.

Expérimentations en cours : comparaison de l’efficacité du mélange huile de paraffine + Teen 20 et de l’huile la plus fluide
Les résultats obtenus en conditions de laboratoire montrent bien l’effet acaricide des huiles que nous avons testées sur le varroa. Les tests de terrain valident cette efficacité. Les premiers résultats obtenus avec un mélange d’huile de paraffine et de tensioactif montraient un effet évident de la présence de couvain. Sans couvain, nous avions obtenu une efficacité de 94 % avec de l’huile de colza dont l’efficacité était moindre en présence de 800 à 1 600 cellules de couvain. Pour la même quantité de couvain, l’efficacité de l’huile de paraffine additionnée de tensioactif était la meilleure et dépassait 97 %. Compte tenu d’une quantité de couvain plus importante lors des tests avec l’huile fluide (deux à trois cadres), on peut penser que l’efficacité de l’huile la plus fluide est au moins égale à celle de l’huile de paraffine plus le tensioactif, mais l’innocuité de celle-ci vis-à-vis des abeilles n’est pas encore démontrée, c’est pourquoi nous développons une expérimentation qui puisse répondre à ces questions.

De plus, plusieurs autres questions restent en suspens :

• la pose de plateaux grillagés est-elle nécessaire ? Les apiculteurs apprécieraient ne pas avoir à poser ces plateaux ou des grilles à varroas !
• quel est le coût pour les colonies d’abeilles en terme de mortalité d’abeilles ? Parmi les 20 colonies testées avec l’huile, 10 sont mortes pendant l’hiver alors qu’elles étaient déjà faibles au début de l’expérimentation. Une expérimentation sur la durée de vie des abeilles pulvérisées avec différentes huiles est prévue cette année.
• des kairomones identifiées sur les larves ont-elles un effet sur la capacité des varroas à quitter les abeilles ?

Pour tester cette hypothèse, nous avons pulvérisé les kairomones mélangées à l’huile de paraffine sur des abeilles maintenues en cagettes, et obtenu une chute des varroa environ trois fois plus rapide qu’avec le contrôle sans kairomones. Considérant ces résultats de laboratoire, il est donc intéressant de savoir si cet effet s’exprime aussi sur des colonies d’abeilles. Pour répondre à ces questions, nous réalisons une série d’expérimentations avec le CNDA. Nous testons l’effet de l’huile la plus fluide comparativement à un mélange huile de paraffine plus Tween 20 qui avaient donné de bons résultats lors des premières expérimentations de terrain. Nous apprécions également l’effet des kairomones. Des trappes à abeilles mortes, que nous venons juste de finir de mettre au point, nous permettent d’estimer le coût de ces traitements pour la colonie d’abeilles. Enfin, une partie des colonies ne dispose pas de plateaux à varroa afin de quantifier l’impact de leur présence sur la survie des parasites.

Conclusion
Les résultats obtenus par cette méthode sont donc très encourageants et pourraient déboucher rapidement sur une méthode fiable pour les apiculteurs. Cette étude, reliée aux travaux effectués par Colin et Le Conte sur les huiles végétales et aux travaux effectués sur les huiles essentielles, pourrait aboutir à la mise au point d’une spécialité acaricide anti-varroa complémentaire aux produits de synthèse actuellement sur le marché, du fait de ses caractéristiques biologiques. Il serait même peut-être possible d’allier effet acaricide et effet acarifuge, perturbant le parasite à plusieurs niveaux par un mélange huile-huile essentielle ou huile kairomone approprié.
Yves Le Conte, Marc Édouard Colin, Michaël Treilles, Didier Crauser et Alain Paris
INRA, Unité de Zoologie et Apidologie, Domaine Saint-Paul, Site Agroparc, 84149 Avignon Cedex 9