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Investigación de dextrinas ajenas a la miel

S. B. Fattori*, S. R. de Gandía y M. E. Laferriere
Administración Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnología Médica 
Instituto Nacional de Alimentos
Estados Unidos 25 (1101) - Capital Federal - República Argentina
* Tel - Fax: 54 11 4340-0800 interno 3522
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Resumen

Se investigó la presencia de maltodextrinas en miel; mezclas de miel y tres jarabes de maíz; mieles elaboradas por abejas alimentadas artificialmente y mieles comerciales utilizando los métodos de Cromatografía en Columna y en Capa Fina. Se determinó la mínima concentración detectable de cada adulterante. Se midió la rotación angular de las muestras. Se demostró que se detectan 0,5g% de jarabe de glucosa y 2g% de jarabe de maíz de alta fructosa a partir de 1,0 g de muestra y 3 ml de solución. Si se parte de 2,0 g de muestra y se siembran 4 ml se detecta 10g% de jarabe de maíz de segunda generación. No se encontró correlación entre los datos del análisis cromatográfico, la relación isotópica 13C/12C y el porcentaje de adulterante. Los valores de la relación isotópica deben analizarse cuidadosamente en el caso de mieles argentinas. El análisis concluyente es la cromatografía en capa fina. La miel no posee residuos detectables de maltodextrinas sólo si se respetan las buenas prácticas de manufactura.

Palabras clave

Miel / Adulteración / TLC / d13C

Introducción

La "miel" es el exudado dulce de néctar de flores recogido, modificado y almacenado en panales por las abejas domésticas. Las abejas pueden utilizar otras fuentes de carbohidratos, un ejemplo de ello es la "miel de mielada" originada a partir de secreciones de ciertos insectos que se alimentan de exudados de plantas y que ellas recogen y almacenan en el panal o de exudados de hojas de plantas que las abejas utilizan directamente [7] La miel, naturalmente puede contener miel de mielada sin que ello signifique una adulteración.

Si la miel se mezcla con edulcorantes nutritivos tales como jarabe de glucosa (JG), jarabe de maíz de alta fructosa (JMAF) o jarabe de azúcar invertido de caña o remolacha, su presencia podrá detectarse estudiando la relación isotópica 13C/12C por Espectrometría de Masa (EM) Este método permite detectar la presencia de azúcares ajenos a la miel procedentes de plantas que utilizan el Ciclo de 4 Carbonos para la fijación del CO2 (maíz y caña de azúcar) ya que la miel deriva de plantas que utilizan el Ciclo de 3 Carbonos en el proceso de la fotosíntesis [6]

Internacionalmente ha sido aceptado un valor de d13C para la miel pura igual a - 25,4 °/°°. Teniendo en cuenta que el valor de ese parámetro para el jarabe de maíz es - 9,7 °/°° las muestras que presenten valores de d13C menos negativos que -21,4°/°° (-19,9°/°° para la miel de citrus) se consideran adulteradas con cantidades significativas de azúcares C-4.
Si los valores están comprendidos entre -23,4°/°° y -21,5°/°° (-21,9°/°° y -20,0°/°° para la miel de citrus) debe utilizarse la técnica de cromatografía en capa fina (TLC) para confirmar la presencia de jarabe de maíz [2]

Un resultado positivo indica la presencia de 5-7% de JMAF y 1-2% de JG. La miel de mielada posee dextrinas y otros compuestos que producen manchas en la misma zona de la placa en la cual se detectan las maltodextrinas Debe realizarse un ensayo confirmatorio (cromatografía en columna (CC) y TLC) para descartar que se trate de miel de mielada.

La TLC es menos sensible para detectar JMAF de segunda y tercera generación ya que, dependiendo de la fuente comercial y del proceso de refinado utilizado en su producción, el JMAF puede contener sólo trazas de polisacáridos. En este caso se recomienda pasar la muestra a través de una columna de carbón y celite eluyendo las dextrinas con alcohol 50%, como paso previo a la TLC, con el fin de concentrarlas. Por otra parte esta metodología permite minimizar las interferencias causadas por la presencia de mielada [4]

Otra alternativa consiste en determinar el valor de d13C de la proteína aislada de la miel y compararlo con el valor de la relación isotópica 13C/12C de la miel original (SCIRA) Una diferencia de -1.00°/°° entre ambos valores es suficiente para comprobar la presencia de una cantidad significativa de azúcares ajenos a la miel.

Mediante este método es posible calcular el porcentaje de azúcares C-4 presentes y sólo si los valores encontrados superan el 7% puede afirmarse que existe adulteración del producto. Valores negativos son considerados 0%.

Desde otro punto de vista, el valor de la rotación óptica específica de la miel depende de la composición de los hidratos de carbono. En general la miel de flores desvía el plano de polarización de la luz polarizada hacia la izquierda mientras que, las mieles de mielada son dextrógiras.

La medición de este parámetro orienta sobre el origen de la miel y ayuda en la detección de adulteraciones.

La alimentación de la colmena con jarabes de maíz se ha convertido en una práctica muy difundida. Las buenas prácticas de manufactura indican que debe suspenderse este tipo de alimentación antes de colocar las alzas melarias destinadas a la cosecha de miel [5] La no observancia de esta recomendación puede conducir a la obtención de una miel con residuos de maltodextrinas, que ha sufrido un cambio en su composición química y como consecuencia es un alimento adulterado [3]

El objetivo fundamental del presente trabajo es hallar la mínima concentración de jarabe de maíz detectable en mieles luego de investigar la presencia de glúcidos ajenos a su composición normal aplicando el método cromatográfico y analizando la relación isotópica 13C/12C y comprobar si existe correlación entre ambos resultados.

Complementariamente ensayar un volumen de siembra que permita detectar la presencia de maltodextrinas sin necesidad de realizar el ensayo confirmatorio por CC. Analizar por TLC muestras de miel provenientes de abejas alimentadas con jarabe para verificar si quedan residuos detectables de maltodextrinas. Paralelamente medir la rotación óptica de todas las muestras analizadas y comprobar si existe una relación entre el valor de este parámetro y el porcentaje de adulterante.

Se demostró que sembrando volúmenes de muestra superiores a los establecidos en el método oficial (2ml ) es posible detectar 0,5g% de JG y 2g% de JMAF. La presencia de 1g% de JMAF de segunda generación puede corroborarse luego de pasar la muestra a través de una columna cromatográfica. Si se siembran 4 ml de muestra preparada partiendo de 2,0 gramos de miel se puede confirmar la presencia de 10g% de ese jarabe.

Si no se respetan las recomendaciones de las buenas prácticas de manufactura la miel posee residuos detectables de maltodextrinas y como consecuencia se considera adulterada.

No se encontró correlación entre los resultados obtenidos a partir del análisis por TLC, por SCIRA y el porcentaje de adulterante. Los valores de la rotación óptica específica encontrados permiten concluir (en algunos casos) que es una determinación útil para orientar sobre una posible adulteración.

Materiales y Métodos

Muestras

· Miel pura.
· Las muestras preparadas en el laboratorio fueron obtenidas mezclando miel pura en distintas proporciones (0,5- 1- 2- 5- 7 y 10 % (m/m)) con tres jarabes comerciales derivados del maíz.
Se utilizó un jarabe obtenido a partir de la hidrólisis ácida del almidón de maíz (GLUCOSA 4338) con un equivalente en dextrosa (ED) igual a 38, 48g% de azúcares superiores (AzS) y 13g% de maltosa (Mal) y dos jarabes de maíz de alta fructosa. Uno de ellos de conversión enzimática con un ED igual a 80, 12g% de AzS y 15g% de Mal (LEVUDEX 400) y otro de segunda generación con 3 g% de AzS (LEVUDEX 55)
· Las muestras de miel de abejas alimentadas artificialmente fueron producidas en las provincias de Buenos Aires, Entre Ríos y Santiago del Estero. Se nutrió una colmena con LEVUDEX 55 (LEV 55) y se suspendió la alimentación antes de colocar las alzas melarias (MIELES A, B y F); otra colmena fue alimentada artificialmente hasta el momento de la cosecha (MIELES C y E) y otra hasta dos meses después de la cosecha (MIEL D). Paralelamente se obtuvieron mieles control alimentando otra colmena con su propia miel.
· Las muestras comerciales de miel fueron adquiridas en el comercio, fraccionadas en su envase original. 
Obtención de la Muestra de Laboratorio 
· Las muestras preparadas en el laboratorio y las compradas en el comercio que se encontraban líquidas fueron homogeneizadas invirtiendo varias veces el recipiente que las contenía; las cristalizadas fueron calentadas a temperatura no mayor de 40ºC hasta su licuefacción. 
· Las mieles líquidas de abejas alimentadas artificialmente que presentaron impurezas fueron filtradas a través de estopa de algodón; las que estaban cristalizadas homogeneizadas con una varilla y aquellas que presentaron impurezas pasadas por un tamiz de 0,50 mm de apertura de malla con la ayuda de una espátula.
· En las muestras contenidas en panales, se eliminó la capa de cera y se extrajo la miel por escurrido.
· Las muestras, a partir de las cuales se obtuvieron las proteínas para el análisis por EM, fueron pasadas a través de un tamiz de 0,104-0,147 mm para eliminar toda materia insoluble en agua que pudiera contaminar el precipitado de proteínas.
Determinación del Contenido de Agua.

La humedad de la miel genuina y de las diferentes mezclas con jarabe fue determinada a 20ºC utilizando un refractómetro Abbé de acuerdo con el método oficial para la determinación de la humedad en miel (AOAC 969.38B)

Esta determinación fue realizada para corroborar si existían diferencias significativas entre el contenido de agua de la miel de partida y las mezclas, en cuyo caso sería necesario concentrarlas y porque ese dato era indispensable para calcular la rotación óptica específica, definida sobre la base de la materia seca.

Investigación de Maltodextrinas

1. El estudio de las todas las muestras analizadas se llevó a cabo de acuerdo con el método oficial para la determinación de glucosa comercial en miel por TLC (AOAC 959.12). Se partió de dos volúmenes de solución de muestra diferentes, 0,5 ml como establece el método y 1,0 ml.

2. Las muestras que arrojaron un resultado negativo aplicando el método anterior fueron analizadas de acuerdo con el método oficial para la investigación de JMAF en miel por TLC (AOAC 979.22)

3. A la luz de los resultados obtenidos se eligió la mínima concentración detectable de cada uno de los jarabes y la inmediata inferior. Las muestras que contenían esa concentración de adulterante fueron analizadas nuevamente por TLC sembrando diferentes volúmenes de muestra procesada: 3,0 - 4,0 y 5,0 ml de muestra mezclada con 0,5% de JG y 2% de LEV 400 respectivamente y 3,0 - 3,5 - 4,0 y 5,0 ml de muestra adulterada con 1% de JG, 5% de LEV 400 y 10% de LEV 55 respectivamente. Se partió del volumen de solución de muestra (0,5 ml) que establece el método oficial.

4. Se repitió el ensayo anterior con la mezcla miel - LEV 55 en una proporción del 10%. Se sembraron volúmenes de 2,0 - 3,0 - 4,0 y 5,0 ml partiendo de 2,0 gramos de muestra.

5. El análisis de la relación isotópica se realizó de acuerdo con el método para la investigación de productos de maíz y caña de azúcar en miel (AOAC 978.17I) Fueron analizadas únicamente las mezclas con JMAF en concentraciones mayores que 5%. 
Las proteínas correspondientes fueron aisladas de acuerdo con el método del standard interno (AOAC 991.41) por precipitación con ácido túngstico. El precipitado se separó por centrifugación y se sometió a cinco ciclos de lavado y centrifugación. El pellet fue secado durante toda la noche a 75°C y al vacío.

Determinación de la Rotación Óptica Específica

Se midió la rotación angular de todas las muestras analizadas en una solución acuosa (12% m/v), clarificada con crema de alúmina y filtrada.

La determinación fue realizada en un polarímetro automático termostatizado a 20°C equipado con una lámpara de sodio en un tubo de 2 dm de longitud utilizando el método para la determinación de la rotación específica adoptado por la Comisión Europea de la Miel [1]

Resultados

Únicamente aquellas muestras que presentaron una serie de manchas azules extendidas desde el origen (punto de siembra) perfectamente identificables fueron consideradas positivas. No se consideró necesario concentrar las mezclas de miel y jarabe ya que no se encontraron diferencias significativas entre los valores del contenido de agua medidos.

1. El análisis por TLC de la miel pura y de las distintas mezclas con cada uno de los jarabes de maíz, partiendo de 0,5 ml de solución de muestra arrojó los resultados que se detallan a continuación. Luego del agregado de alcohol absoluto todas las muestras adulteradas con JG y con LEV 400 presentaron turbidez.

a) La mínima concentración de JG detectable fue de 1g%.

b) La mínima concentración de LEV 400 detectable fue de 5g%.

c) No fueron detectadas maltodextrinas en las mezclas con LEV 55.

No se encontraron diferencias significativas entre los resultados anteriores y el análisis equivalente, partiendo de 1,0 ml de solución de muestra.

2. No se observaron diferencias significativas entre las distintas mezclas de miel con LEV 55 luego del análisis por CC - TLC. Concentraciones de 1 y 2g% de jarabe fueron perfectamente identificables.

Las muestras de miel de abejas alimentadas con jarabe de maíz, respetando las recomendaciones de las buenas prácticas de manufactura no presentaron residuos detectables de maltodextrinas; no así cuando la alimentación continua luego de colocar las alzas melarias.

La tabla I muestra los resultados del ensayo conjuntamente con los valores de la rotación óptica específica.

Tabla I: Resultados de la Investigación de Maltodextrinas por TLC
y de la Rotación Óptica Específica en Mieles Provenientes de Abejas Alimentadas Artificialmente.

 MUESTRA
(Origen)

 Maltodextrinas (TLC)

 Maltodextrinas
(CC - TLC)

 Rotación Óptica Específica

 Miel A (Buenos Aires)

 Negativo

 Negativo

 - 15,4

 Miel B (Buenos Aires)

 Negativo

 Negativo

 - 9,2

 Miel C (Entre Ríos)

 Positivo(*)

 ---------

 - 10,5

 Miel D (Entre Ríos)

 Positivo(*)

 ---------

 - 12,6

 Miel E (Santiago del Estero)

 Positivo

 ---------

 - 12,7

 Miel F (Buenos Aires)

 Negativo

Negativo

 - 19,4

(*) No fueron observadas diferencias en el contenido de maltodextrinas con la alimentación prolongada.

3. Los resultados del análisis de las mezclas en la concentración mínima detectable y en la inmediata inferior, partiendo de 0,5 ml de solución de muestra, y sembrando diferentes volúmenes de muestra procesada son los siguientes:

a) Puede detectarse la presencia de maltodextrinas sembrando 3,0 ml de una miel adulterada con 0,5% de JG.

b) Puede detectarse la presencia de maltodextrinas sembrando 3,0 ml de una miel adulterada con 2% LEV 400.

c) No fueron detectadas maltodextrinas en la miel adulterada con 10 % de LEV 55 para ninguno de los volúmenes ensayados.

4. Puede detectarse la presencia de maltodextrinas sembrando 4,0 ml de una miel adulterada con 10% de LEV 55 partiendo de 2,0 gramos de muestra.

5. En la tabla II se presentan los resultados del estudio de las relaciones isotópicas 13C/12C sobre materia orgánica de las muestras y de las proteínas aisladas de ellas y de la rotación óptica específica. Los valores encontrados en las mezclas con JG en orden creciente de porcentaje de adulterante, para este último parámetro, fueron - 7,1; - 5,6; - 1,7; - 0,4 y - 0,1 respectivamente.

TABLA II: Relación Isotópica 13C/12C y Rotación Óptica Específica de la Miel y sus Mezclas.

 MUESTRA

 

 d13C°/°°

 d13C°/°°  de la proteína

 Porcentaje  de Azúcares C-4

 Rotación Óptica Específica

 Miel pura

 -26,3 ± 0,2

 -26,1 ± 0,2

 ---------

 - 11,7

Glucosa 4338

 -10,7 ± 0,2

 ---------

 ---------

 + 149,5

 Levudex 400

 -10,7 ± 0,2

 ---------

 ---------

 + 76,7

 Levudex 55

 -10,7 ± 0,2

 ---------

 ---------

 - 20,8

  5% de Lev 400

 -26,3 ± 0,2

 -26,4 ± 0,2

 ---------

 - 9,0

 7% de Lev 400

 -25,9 ± 0,2

 -27,1 ± 0,2

 7,3%

 - 7,5

 10% de Lev 400

 -25,5 ± 0,2

 -26,4 ± 0,2

 5,4%

 - 4,5

 5% de L EV 55

 -25,9 ± 0,2

 -26,3 ± 0,2

 ---------

 - 11,9

 7% de LEV 55

 -25,7 ± 0,2

 -26,2 ± 0,2

 ---------

 - 13,1

 10% de LEV 55

 -25,2 ± 0,2

 -26,2 ± 0,2

 6,5%

 - 20,8

· La tabla III muestra los resultados de los análisis realizados sobre las muestras de miel comerciales.

TABLA III: Resultados de los Análisis de Genuinidad de Mieles Comerciales.

 MIEL

 TLC

  CC - TLC

 d13C°/°°

d13C°/°°  de la proteína

 Porcentaje e Azúc. C-4

 Rotación Óptica Específica

 Nº 1

 Dudoso

 Positivo

 -26,2 ± 0,2

 ---------

 ---------

 - 11,3

 Nº 2

 Positivo(*)

 Positivo

 -25,1 ± 0,2

 -26,2 ± 0,2

6,8%

 - 10,5

 Nº 3

 Positivo(*)

 Positivo

 -25,5 ± 0,2

 ---------

 ---------

 - 11,4

 Nº 4

 Negativo(**)

 Positivo

 26,2 ± 0,2

 ---------

 ---------

 - 10,4

 Nº 5

 Negativo(**)

 Positivo

 -24,5 ± 0,2

 -25,5 ± 0,2

 6,3%

 - 14,7

 Nº 6

 Dudoso

 Positivo

 -26,2 ± 0,2

 ---------

 ---------

 - 13,6

 Nº 7

 Negativo

 Positivo

 -25,4 ± 0,2

 ---------

 ---------

 - 14,8

 Nº 8

 Positivo

 ---------

 -25,7 ± 0,2

 -24,9 ± 0,2

 0%

 - 28,7

(*) El volumen de siembra fue de 2 ml.
(**) Precipitó un gel luego del agregado de alcohol absoluto.

Discusión

· La presencia de algunos JMAF puede detectarse fácilmente por TLC mientras que otros, con muy baja proporción de dextrinas, sólo es posible ponerlos en evidencia luego de pasar la muestra a través de una columna de carbón y celite. Si se utilizan volúmenes de siembra mayores o se parte de una masa de muestra mayor que la establecida en el método oficial es posible detectar mieles mezcladas con porcentajes menores de jarabes de maíz y evitar, en algunos casos, el ensayo confirmatorio pasando la muestra por la columna. De este modo el análisis sería más rápido y menos tedioso. 
· Si no se interrumpe la alimentación artificial de la colmena antes de colocar las alzas melarias en el producto quedarán residuos de maltodextrinas y como consecuencia la miel se considerará adulterada.
Es interesante observar que las muestras de miel de abejas alimentadas con LEV 55 dieron positivo el ensayo por TLC mientras que no fue posible detectar dextrinas por este mismo ensayo en el jarabe tal cual.
· La rotación óptica específica es un dato interesante que puede orientar sobre una posible adulteración con jarabe de maíz dextrorrotatorio; en el caso de jarabes levógiros la utilidad del ensayo queda restringida a altas concentraciones de adulterante. 
· Los valores de d13C para la miel pura y los jarabes superan los valores aceptados internacionalmente, como consecuencia mieles adulteradas con 7% de jarabe no pueden detectarse analizando la relación isotópica 13C/12C por espectrometría de masa y mieles con porcentajes mayores de jarabe no reflejan el contenido real de adulterante.
· Los resultados anteriores no pueden considerarse concluyentes ya que sólo fue analizada una pequeña cantidad de muestras pero, en una primera aproximación es posible concluir que los valores de la relación isotópica 13C/12C deben analizarse cuidadosamente en el caso de mieles argentinas.

El análisis concluyente es sin duda la cromatografía en capa fina.

Agradecimientos

Los autores desean expresar su agradecimiento al Dr. José Maidana del Centro de Investigaciones Apícolas de la Universidad Nacional de Santiago del Estero, a la Dra. Berta Baldi de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Entre Ríos y al Dr. César Tapia del Ateneo Argentino de Apicultura por la colaboración brindada para obtener las muestras de miel de abejas alimentadas artificialmente.

Bibliografía

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[2] FAO, Manuals of Food Quality Control. Food Analysis: Quality, Adulteration and Tests of Identity. FAO FOOD AND NUTRITION PAPER 14/8, Rome, (1986), 114-117.
[3] Fiehe, J., Uber die Zusammensetzung und Beurteilung von Zuckerfütterungshonig, Z. Unters. Lebensm. 55 (1928), 169-173. 
[4] Kushnir, I., Sensitive Thin Layer Chromatographic Detection of High Fructose Corn Syrup and Other Adulterants in Honey, Journal of Official Association Agricultural Chemists International Vol.62, N° 4 (1979), 917-920. 
[5] Miel: Buenas Prácticas de Manufactura. Guía de Aplicación. Normas y Legislación Vigente, El Obrador Gráfica + Diseño S.R.L., Buenos Aires, 1998, pp. 17-20.
[6] White, J., Internal Standard Stable Carbon Isotope Ratio Method for Determination of C-4 Plant Sugars in Honey: Collaborative Study, and Evaluation of Improved Protein Preparation Procedure, Journal of Official Association Agricultural Chemists International Vol.75, N° 3 (1992), 543-548. 
[7] Winton, A. L, Ph.D. and Winton, K. B.,Ph.D., The Structure and Composition of Foods, John Wiley & sons, Inc., New York 1939, Vol IV, pp. 45-66.

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